质粒生产下游工艺的第一步就是细胞裂解，原理上细菌的裂解可通过物理，酶或化学方法实现，由于核酸分子的物理化学特性，其对剪切力极为敏感，所以常规的高剪切力的物理裂解方法并不适用，酶裂解方法由于酶的动物源性，出于有引入传染病病原体风险的考虑也不适宜作为治疗用质粒的裂解方法，目前最常用的大规模的裂解方法是化学裂解，即碱裂解方法，此方法最初在1979年由Birnboim 和Doly提出，通过0.2 N NaOH和1% sds处理细胞，使细菌细胞壁破坏，将质粒在内的细胞内含物释放出来，形成黏度极高的裂解液，在此种条件下，细胞中的大部分gDNA和蛋白质变性，而质粒由于其共价闭合的双螺旋结构能保持完整。但此种方法也存在弊端，即在混合溶液时局部的pH过高和搅拌过程中产生的剪切力可能会对质粒造成不可恢复的损伤，除此之外可能会使gDNA 断裂而增加下游纯化的困难，这里介绍一种连续流裂解工艺，由内蒙古工业大学和北京放射医疗研究所于2011年发布，可以有效解决这类问题，一步完成碱裂解、中和、澄清，获得更高的收率和纯度。

此套设备由一组300KD中空纤维（U），3个蠕动泵（①②③），2个螺线管（S1,S2），振荡器（C4）和过滤器（C5）组成。通过蠕动泵①将重悬后的细菌泵入中空纤维，而后通过蠕动泵②将碱裂解液泵入中空纤维滤出端，这样碱裂解液通过中空纤维膜上的小孔渗透进入中空纤维内部，与细胞均匀混合，避免了局部的pH过高和剪切力。通过控制蠕动泵流速控制碱裂解液和细菌重悬液的比例及接触时间。值得注意的是碱裂解液泵入的入口选择会显著影响碱裂解的效果，从A和B分别泵入碱裂解液收率差距可达9%。

除此之外实验结果显示，在此工艺中流速对质粒质量有着很大的影响，他影响了质粒与碱裂解液的接触时间，流速过快导致接触时间过短使细菌裂解不完全，长时间的碱处理质粒会发生不可逆的变性，引入gDNA污染。

裂解后的细胞从中空纤维滞留端流出，在管道内与中和液接触，在C4振荡器中混匀，过滤后回收，得到澄清的碱裂解液。可直接用于下游的层析纯化步骤。该方法用到的设备简单，重复性好易控制易扩大可适用于工业规模的质粒制备。

参考资料：

[1]Chunsheng, Hu, Zhang Qinglin, Lu Yuxin, Cheng Xiaochen, Wang Yanliang, Zhang Tong, and Wu Zuze. "A continuous cell alkaline lysis, neutralization, and clarification combination process for production of plasmid pUDK‐HGF." Biotechnology and Applied Biochemistry 58.3 (2011): 162-165.

[2]Urthaler J, Ascher C, Wöhrer H, Necina R. Automated alkaline lysis for industrial scale cGMP production of pharmaceutical grade plasmid-DNA. J Biotechnol. 2007 Jan 30;128(1):132-49. doi: 10.1016/j.jbiotec.2006.08.018. Epub 2006 Sep 10. PMID: 17129627.