质粒DNA (pDNA) 是一类能在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传的环状双链DNA分子，经过基因工程改造后可以接入外源DNA作为基因载体，转入宿主细胞。自20世纪50年代发现质粒以来，质粒已经影响了分子生物学的许多领域，成为一个重要的基因工程工具。pDNA可用于克隆、扩增和表达目的蛋白；病毒载体和mRNA的生产也需要pDNA；GMP级别的pDNA还可用于DNA疫苗、基因治疗和细胞治疗等领域。

《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则（试行）》将质粒DNA模板作为原液生产工艺部分管理，须由企业自主生产。为满足药用质粒临床应用的纯度和可放大性的要求，Cytiva推出了成熟稳健的三步层析法，同时开发了多种具有灵活选择性的两步层析工艺法，具有很强的实用性。今天，Cytiva智荟专线将为大家一一道来。

质粒生产过程

质粒生产一般选择大肠杆菌作为宿主细胞，经发酵培养后裂解细胞得到质粒。裂解后的料液中存在多种质粒形式：超螺旋质粒DNA (scDNA) 、开环DNA (ocDNA) 、线性DNA和质粒DNA聚集体等。另外，还伴随有宿主蛋白 (HCP) 、宿主核酸 (HCD) 、RNA、内毒素等杂质。在生物制造过程中应用最为广泛的是5-20 kb的超螺旋质粒DNA，其纯度对目标生物分子的质量以及生物技术过程的整体效率、可持续性和稳健性有很大影响。所以质粒DNA的纯化是其生产过程的关键步骤。

曾经氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是制备大量质粒DNA的首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展开发了层析纯化替代工艺。Cytiva开发的质粒生产工艺路线（如图1），可以帮助客户获得高纯度、高质量的质粒产物。

图1：质粒生产的一般过程

质粒发酵工艺开发进程

1

摇瓶培养：一些关键工艺参数不可控，如DO、pH和通气等，菌体密度OD600和质粒Titer都很低。

2

小型的玻璃罐反应器或不锈钢罐反应器：CIP、SIP和验证过程显著增加了批间周转时间，降低了工艺开发效率和生产效率。

3

一次性生物反应器：具有快速的批次间切换能力，且避免了多质粒、多批次生产的交叉污染。关键工艺参数，如DO、pH、温度、通气流速等都可自动控制和程序化设定。

Cytiva Fast Trak工艺开发中心的研究成果证实了XDR 200 MO反应器具有稳定且高效的参数控制性能，能支持大肠杆菌的高密度发酵，且具有很好的放大重现性。

质粒纯化前处理工艺开发进程

菌体收集：由传统的离心操作升级为中空纤维膜过滤

离心：操作繁琐，容易产生污染，难以工艺放大，工艺验证困难，成本/维修成本高昂。

中空纤维膜过滤：产品种类型号齐全，菌体收集推荐孔径750 KDa-0.1 µm，内径1 mm的中空纤维膜。物理化学耐受性好，可耐受1 M NaOH和300 ppm次氯酸钠加热50度下彻底CIP清洗，水通量恢复完全，寿命长且成本低；大多数中空纤维膜还可以反复高压灭菌或在位蒸汽灭菌（配合不锈钢外壳）；适合处理高浓度、黏度、颗粒度的样品；全封闭操作、全自动控制；工艺可优化和线性放大；符合cGMP/FDA严格的安全、可控认证要求。

菌体破碎：由传统的冻融或超声破碎升级为碱裂解或高压破碎

冻融：当细胞冷冻至-20℃或-70℃时，细胞内外的水分和某些无机盐成分形成结晶，引起细胞膜的破坏，反复冻融的过程可使细胞完全破坏，不适合大规模生产。

超声破碎：利用超声波（通常20,000Hz）在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使液体中的固体颗粒或细胞组织破碎，不适合大规模生产。

碱裂解：利用酶、表面活性剂、碱液等使细胞膜、细菌胞壁等破裂，或是改变细胞壁或细胞膜的通透性，最终使大部分细胞壁及细胞膜成分裂解，适合大规模生产。目前常用的方法是传统的碱裂解方式^【1】，碱性条件下，大肠杆菌的蛋白质、RNA、宿主DNA和质粒释放至溶液中并变性。加入中和液后，质粒DNA可以复性并保持溶解性，大量变性的蛋白质和宿主DNA通过疏水作用结合在一起而沉淀下来。

高压破碎：利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放，在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下破碎细胞，适合大规模生产。

澄清：可考虑多种不同的澄清技术，取长补短，组合达到最优

澄清方法包括：离心；添加絮凝剂（硫酸铵沉淀，CaCl₂沉淀）；添加NH₄HCO₃^【2】或NaHCO₃，自然分层；分级过滤20 µm-0.6 µm~0.4 µm；深层过滤等。

在裂解过程中添加硫酸铵或者CaCl₂可沉淀去除RNA，常用于质粒纯化两步法的样品前处理阶段，利于pDNA的捕获。添加NH₄HCO₃能产生大量CO₂与NH₃，添加NaHCO₃能产生大量CO₂，气体能够带动絮凝物上浮至液体表面，可以将澄清液从容器底部排出。PDK11深层滤器能对底部液体进行过滤，完成裂解后料液的澄清，其载量为100-300 L/m²，澄清度较好，具有高产品回收率、高容污能力，工艺稳健，可线性放大。

浓缩：使用切向流过滤 (TFF) 系统搭配中空纤维进行浓缩，获得目标质粒浓度

根据质粒DNA产物大小，按如下标准（表1）进行中空纤维的选择。

表1：根据质粒大小的中空纤维选择推荐

质粒层析纯化工艺开发进程

经典的三步法层析纯化质粒

图2：质粒纯化传统三步法和新三步法

如图2所示，质粒纯化三步法如下：

第一步：传统三步法中使用Sepharose 6 FF分子筛层析，可收获质粒DNA，去除RNA、蛋白等大量杂质。分辨率高，通量能达到0.2-0.3 CV，收率一般>90%，具有缓冲体系更换能力，直接衔接下一步工艺。新三步法中使用Capto Core 700代替Sepharose 6 FF，Capto Core 700为复合模式层析填料，质粒DNA等大分子不能通过其惰性外壳的孔进入核内，经过外水直接流穿，而较小杂质如RNA片段、蛋白质与内毒素片段等经过小孔进入内核，与核内的辛胺基团结合，达到分离的目的。Capto Core 700的通量取决于内核配基对杂质的吸附量，根据样品的性质，上样量可以多达5-20 CV，且样品不会被稀释，线性流速高，大大提高了这一步层析的生产率。

第二步：使用嗜硫亲和层析，主要分离ocDNA和scDNA，提高质粒的均一性。嗜硫亲和层析填料早期使用的是PlasmidSelect Xtra（载量>2 mg 超螺旋质粒/mL），目前已升级为高流速、高载量、刚性骨架的Capto PlasmidSelect （载量≥3.0 mg 超螺旋质粒/mL），收率一般>70%，收率低时可考虑延长洗脱液的孵育时间。

第三步：使用阴离子交换层析，精纯，去除痕量杂质，如gDNA、内毒素、宿主蛋白等。阴离子交换层析填料早期使用的是Source 30Q ，利用高分辨率去除痕量杂质。为了进一步提高回收率，可以替换为Capto Q ImpRes（收率一般>80%）。

Cytiva传统的质粒纯化三步法，：

灵活的两步法层析纯化质粒

图3：质粒纯化两步法

图3中展示了三种不同的质粒纯化两步法，总结如下：

CaCl₂沉淀或硫酸铵沉淀都可以去除RNA。研究时发现，不同的浓缩倍数、CaCl₂或硫酸铵浓度以及料液pH等均会影响沉淀效果，需要进行工艺优化^{【3, 4】}。产生的沉淀可通过离心或过滤等形式进行去除，去除沉淀后的料液将用于后续层析工艺的上样。

Mustang Q、Capto Q ImpRes等阴离子交换层析介质可用于内毒素、宿主蛋白及宿主核酸的去除。Capto PlasmidSelect嗜硫亲和层析介质可用于开环DNA (ocDNA) 的去除，工艺可靠，易于放大。疏水层析介质Capto Phenyl/Butyl ImpRes也能用于捕获scDNA，去除ocDNA。

Capto Core 700同时具有Sepharose 6 FF和Capto Q ImpRes的功能，且采用流穿模式进行纯化，因此具有高的处理通量，结合嗜硫亲和层析或疏水层析，可作为新的两步法工艺。

Cytiva灵活的质粒纯化两步法

两步法和三步法对比

Mustang Q采用膜层析技术，可实现质粒的高效捕获，是AIEX-Capto PlasmidSelect两步法的重要步骤。如图4所示，该两步法的整个工艺流程的硫酸铵用量比传统三步法减少了近52%，工艺时间降低近79%，Capto PlasmidSelect洗脱液可根据后续工艺的要求，通过中空纤维浓缩换液到相应的制剂溶液中，经无菌过滤，再通过紫外吸光、HPLC等方式进行检测。结果表明，超螺旋质粒DNA (scDNA) 的纯度能达到99.3%，杂质去除效果也很好，超过验收标准。

图4：新两步法与传统三步法比较

在上面的微文中，也进行了两步法和传统三步法的比较，案例中是Capto Core 700-Capto PlasmidSelect两步法，该两步法的整个工艺流程的硫酸铵用量比传统三步法减少将近一半，工艺时间降低近70%，填料用量大幅减少，可节约近一半的填料费用。由此可见，质粒两步纯化从经济效率方面更胜一筹。

两步法对上游的发酵工艺和纯化前处理工艺要求较高，需考虑其可操作性及通用性。目前，稳健的质粒三步法已有多种上市产品工艺，可快速拉通工艺，确保质粒产品质量符合标准，适合作为项目的起始工艺。在稳健的裂解和超滤工艺基础上也可选择创新的两步法，减少工艺步骤，利于生产操作。